F&E im AK SHH

Scientific CV

Stefan H. Huettenhain

After completing my thesis on Lewis-acid mediated alkylation of ketones in the research group of M. T. Reetz in 1982 I joint the Fraunhofer Institute for environmental chemistry and ecotoxicology to work on divers projects concerning detection and analyses of highly toxic substances and respective decontamination methods.

Research on the environmental safety of firefighting agents illuminated different aspects of the interaction of foams, powders and Halon gases with divers surroundings. Especially the reactions of the halogenated methans were studied intensively even under extreme conditions like in a running Diesel motor. (Chemosphere, 1991, 23, 1453).

After becoming the head of one of the two chemistry departments of the Institute, my research interests focused on matrix effects while developing analytical methods based on the solvatochromic fluorescence of 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid. We could show that this molecule is an ideal differentiating fluorescence probe for liquid environmental contamination as well as a coloring agent for personal safety badges or as a chromatographic stain for TLC and HPLC. Academic research beside this practical applications showed, that in addition to its polarity the protolytic properties of the solvent used are crucial for 8,1-ANS’s fluorescence. (Z. Naturforsch. 1993, 48a, 709)

After accepting the position of a professor of organic chemistry at the university of applied sciences, Darmstadt, environmental research work continued developing new concepts for analyses and work up of contaminated soils. In the medium pressure liquid extraction those soils were ground with silica to disturb contaminant / matrix interaction. The resulting homogenous phase could be placed in a chromatographic tube and the pollutants were eluted successively. No further clean up was necessary prior o measurement. (Chemosphere 1998, 37, 2375) Since 1999 questions of matrix influence in organic syntheses became more and more the focus of my research work; I was interested in solvent induced asymmetric syntheses. Unlike other groups we refrain from studying chiral ionic liquids but stay to simple molecules derived from the natural chiral pool. (Tetrahedron 2006, 62,12420)

At present we optimize homochiral synthesis of 3-hydroxy fatty acid esters either by enzyme catalyzed kinetic resolution or by baker’s yeast reduction of appropriate hydrophilic esters.( Synth. Commun., 2012, 42, 1019-1025; ChemCatChem 2012, 4, 2050-2054).

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Die Arbeitsgruppe von Stefan H. Hüttenhain beschäftigt sich z.Z. mit den Matrixeinflüssen (Solvens) auf enzymatische Reaktionen; speziell der Reaktionsbeschleunigung von Lipasen in Triethylamin.

Anbei die letzten Publikationen. 200355  LSYC_535132

Weiter werden z.Z Synthesemethoden für hydrophile 3-Ketoester bzw. 3-Hydroxy-Ester langkettiger Fettsäuren entwickelt. Studentische Mitarbeiter sind im Rahmen von Wahlpflicht-Praktika willkommen.        Hier etwas Lesestoff:

Darstellung homochiraler 3-Hydroxyfettsäureester.

Stefan H. Hüttenhain, Hochschule Darmstadt, Fachbereich Chemie und Biotechnologie,

Hochschulstrasse 2, 64289 Darmstadt

Enantiomerenreine 3-Hydroxycarbonsäuren CH₃(CH₂)_nCH(OH)CH₂COOH oder ihre Ester sind wertvolle Bausteine für pharmazeutische Wirkstoffe und auch ganz allgemein für Naturstoff-Synthesen[1-4]. Meist werden eher kurzkettige oder cyclische Verbindungen benötigt und so findet man wenig Darstellungs-Beispiele mit n > 4. So auch bei VanNieuwenhze et. al., die den benötigten 3-Hydroxy-14-methypentadecansäureallylester durch kinetische Racematspaltung von 3-Hydroxypent-4-encarbonsäuretertiärbutylester mit anschließender Grubbs Metathese mit 11-Methyl-1-dodecen und Umesterung erhalten [5]. Prinzipiell können homochirale längerkettige 3-Hydroxy-Fettsäuren aber auch durch kinetische Racematspaltung oder durch Hefereduktion erhalten werden, wie Ikanuaka für die 3-Hydroxytetradecansäure zeigen konnte [6]. Solche 14-C-Fettsäuren sind auch ein wesentlicher Bestandteil von Lipid A, dem lipophilen Teil der Zelloberflächen – Lipopolysaccharide von Gram-negativen Bakterien. Sie ist hauptsächlich verantwortlich für die Expression deren biologischer Aktivität und daher Gegenstand vielfältiger Forschung [7,8]. Die enantiomerenreine Darstellung der Fettsäuren kann auch hier über eine enzymatische Acylierung erfolgen, oder aber durch asymmetrische Sharpless Hydroxylierung eines terminalen Alkens mit anschließender selektiver Umwandlung des endständigen Hydroxyds in eine Carbonsäurefunktionalität [9]. Dies ist eines der wenigen Beispiele, in denen 3-Hydroxyfettsäuren bzw. deren Ester nicht durch die Reduktion der entsprechenden 3-Oxocarbonsäuren oder deren Ester erreicht wird.

Da die Oxo – Verbindungen leicht zugänglich sind, ist deren Umwandlung die Regelsynthese [10-12]. Aus den vielfältigen Reduktionsmöglichkeiten muss der Synthesechemiker dann noch den Weg auswählen, der ihm die gewünschte Verbindung in hoher Ausbeute und hohem ee liefert. Dem Stand der Technik entsprechen dabei Ruthenium katalysierte Hydrierungen nach Noyori, biotechnologische Reduktion durch Hefefermentation, oder klassische Reduktion mittels Hydrid mit anschließender enzymatischer Enantiomeren-Trennung. Ein neuerer Ansatz ist die Depolymerisation mikrobieller Polyhydroxyalkanoate [13].

Ru-Binap Komplexe, wie auch kürzlich noch von Brückner beschrieben, stellen dabei den Gold-Standard hinsichtlich Ausbeute und ee dar, in der Regel werden sowohl als auch Werte im oberen 90% Bereich erzielt [13,14]. Da man je nach Verwendung des (R) oder (S) Binap-Liganden die Stereochemie im Produkt frei steuern kann, erscheint es auf den ersten Blick verwunderlich, dass trotzdem noch nach anderen Möglichkeiten gesucht wird. Der Grund liegt wohl in der aufwendigen Handhabung des empfindlichen Katalysators sowie seinem Preis. Vor allem die biotechnologische Reduktion von 3-Oxoestern mittels Hefefermentation, die in den Anfängen enantioselektiver Synthesen das wichtigste Werkzeug des synthetischen Chemikers zur Gewinnung homochiraler Verbindungen war, wurde und wird intensiv untersucht [15,16]. Wie auch in der klassischen Vorschrift von Seebach findet man aber meist nur kürzerkettige oder cyclische Oxoester als Edukte [17]. Oft wurden Optimierungen mit den Edukten 3-oxobutansäureethylester (Acetessigester) und dem 4 –Chloro-acetessigester durchgeführt. Dabei stand im Vordergrund, die unterschiedlichen Enzymsysteme der Hefe, die sich an der Reduktion beteiligten, selektiv zu inhibieren, um die Enantioselektivität zu erhöhen bzw. zu steuern. Die Arbeiten von Chin-Joe und Straathof konnten zeigen, dass sich durch niedrige Versorgung mit Elektronendonatoren für die Reduktion, Glukose oder Ethanol, eine Verringerung der Biomasse bei gleichzeitiger Erhöhung des ee erzielen lässt; was für die Aufarbeitung in einem industriellen Prozess erstrebenswert ist. Weiter berichteten sie darüber, dass vorhandene Hydrolasen der Hefen die Edukte und die gebildeten Hydroxyester hydrolysieren und die Hydrolyseprodukte weiter metabolisiert werden [18, 19]. Konkurrierende Enzymsysteme wie diese Esterasen senken die Ausbeuten und können durch selektive Hydrolyse den ee senken, vor allem aber sind es die diversen Oxidoreduktasen der Hefe mit entgegengesetzter Enantiospezifität, die die optische Reinheit der Produkte erniedrigen. So fehlt es nicht an Publikationen, diese Enzyme selektiv zu inhibieren, durch Hitze oder verschiedenen Chemikalien wie Allylalkohol, Allylbromid oder Vinylacetat und an biotechnologischen Versuchen, nur ein Enzym überexprimieren zu lassen [20-22]. Da unterschiedliche Substrat Bindungskonstanten der Enzyme bestehen, lässt sich auch durch Variation der Edukt-Konzentration die Selektivität steuern [23].

Alle diese Optimierungen wurden mit den o.g. Standard-Substraten durchgeführt, die Reaktionsbedingungen für die Reduktion langkettiger 3-Oxoester wurden nicht bearbeitet. Dass es signifikante Unterschiede in deren Verhalten gibt, zeigen die wenigen Publikationen, die sich mit diesen Reaktionen beschäftigen. Schon 1983 zeigte Hirama, dass die 6-Benzyloxy-3-oxohexansäureester nicht als Substrat für eine Hefereduktion taugten, sondern nur deren Salze. Auch Utaka konnte den 3-Oxostearinsäuremethylester erst nach intermediärer Verseifung zur entsprechenden Hydroxysäure reduzieren [24,25]. Es ist zu vermuten, dass die Ester aufgrund ihrer Hydrophobie zu wenig bioverfügbar sind. Utaka war es auch, der eine systematische Untersuchung zur Hefereduktion langkettiger β-Ketosäuren bis C-18 veröffentlichte [26]. Das Papier beschreibt ausführlich die Reaktionsbedingungen und den zeitlichen Verlauf der Reduktion sowie die Stereochemie der gewonnenen Hydroxysäuren. Während die ee Werte durchweg ausgezeichnet sind (>98%), sind die chemischen Ausbeuten moderat bis mäßig. Neben den bekannten Schwierigkeiten der Aufarbeitung zeigen die Ergebnisse deutlich, dass ein beachtlicher Teil des Edukts nach bekanntem Mechanismus decarboxyliert, es werden entsprechende Mengen des resultierenden Methylketons gefunden.

Eine Alternative zur enantioselektiven Reduktion stellt die klassische Hydrierung dar [27], der anschließend die Racematspaltung folgen muss [5-8]. Systematische Variationen der Reaktionsbedingungen zur Gewinnung der homochiralen langkettigen Hydroxyfettsäuremethylester C-6, C-8 und C-10 mittels enzymatischer Spaltung wurden daher auch schon 1993 beschrieben. Mehrere Lösungsmittel, Enzyme und Acylierungsmittel wurden für C-8 getestet und die optimalen Bedingungen auf die anderen Ester übertragen. Es lassen sich in allen Fällen Bedingungen finden, in denen ein Enantiomer mit sehr guter Reinheit gewonnen werden kann, das andere ist aber nur bedingt optisch rein [28,29]. Diese oft gefundene Tatsache bei kinetischer Racemattrennung mittels Enzymen verbessern Fishman et al bei der Gewinnung von (S) und (R) 3-Hydroxybuttersäureethylester im großen Maßstab. Ein 2-Schritt-Prozess führt für beide Produkte zu guten Ausbeuten mit hohem ee [30].

Die Ausführungen zeigen, dass mit biotechnologischen Methoden bisher nur in Einzelfällen langkettige 3-Hydroxyfettsäureester in guten Ausbeuten mit hoher optischer Reinheit erzielt werden. Das Hauptproblem der Ganzzelltransformation scheint vor allem in der schlechten Bioverfügbarkeit der Ketoester und der schnellen Decarboxylierung der Ketosäuren zu liegen, wie in [24-26] dargelegt. Die Lösung dieses Problems liegt entweder in der Möglichkeit, die Ester bioverfügbarer zu machen oder die Kinetik der enzymatischen Hydrierung so zu beschleunigen, dass sie wesentlich schneller abläuft als die Decarboxylierung. Da wir für letzteres keinen geeigneten Ansatz sehen, wollen wir versuchen, Ester und Enzym besser in Kontakt zu bringen. Ein erster Ansatz ist das Arbeiten mit Lösungsvermittlern wie Tween oder auch DMSO um die unpolaren Ester besser im wässrigen Medium zu verteilen. Es könnte aber auch sein, dass die Zellmembran der Hefen eine Barriere für die ihr sehr ähnlichen Stoffe darstellt und die Ester einlagert. Arbeiten im zellfreien Lysat, wo die Zellwand der Hefe zerstört ist und der Zellinhalt (Enzyme/Co-enzyme) frei vorliegt, sollen das zeigen.

Ein gänzlich neuer, wenn auch zunächst ungewöhnlicher Ansatz, wäre der Umsatz der Ester mit Hefe in (wässrigem) Allylalkohol; die Ester lösen sich darin und gemäß [21] erhöht dieser Alkohol die Stereospezifität durch spezifische Hemmung einer Reduktase.

Vielversprechend ist auch die Modifikation der Alkoholkomponente des Esters. Zwar führen die gängigen Darstellungen [10-12] zu Ethyl- oder Methylestern, es sollte aber möglich sein, diese z.B. mit Glykolen, Inositol oder einem Zucker umzuestern und so eine große hydrophile Gruppe einzuführen, die die Wasserlöslichkeit nachhaltig verbessern sollte. Ob diese Moleküle noch als Substrat von den Hefen erkannt werden, muss das Experiment zeigen.

Auch bei der kinetischen Racemattrennung ist noch Arbeit zu leisten. Eine systematische Analytik der Enzymkinetik für diese Veresterung ist unseres Wissens noch nicht beschrieben und sollte unbedingt unternommen werden. Für die Ausarbeitung eines analytischen Verfahrens müssen Bedingungen gefunden werden, in denen Edukt und Produktpeaks enantiomerenrein getrennt aufgenommen und quantifiziert werden können. Es können dann für alle homologen Ester Zeitverläufe bis zur wieder beginnenden Racemisierung aufgenommen werden. Eventuell ergibt sich so eine Korrelation mit der Kettenlänge.

Dann soll die Beeinflussung der Variation des Esteralkohols auf die Kinetik und die Selektivität untersucht werden.

Auch unterschiedliche Veresterungs-Substrate (Kettenlänge; Acetat vs. Laurat) können die Kinetik und den ee beeinflussen genauso wie der Einsatz einer anderen (Pseudomonas) Lipase.

Letztendlich wäre zu untersuchen, ob die Selektivität der Esterspaltung mit der Veresterung korreliert.

Literatur

1) Hayakawa, K:, Nagatsugi, F.; Kanematsu, K.; “Total Synthesis of (+)-4-Oxo-5,6,9,10-tetradehydro-4,5-secofuranoeremophilane-5,1-carbolactone via Novel Lactone Construction through Allene Intramolecular Cycloaddition” J. Org. Chem. 1988, 53, 860-863.

2) Santaniello, E.; Ferraboschi, P.; Grisenti, P.; Manzocchi A. “The Biocatalytic Approach to the Preparation of Enantiomerically Pure Chiral Building Blocks” Chem. Rev. 1992, 92, 1071-1140.

3) Williams, R.M.; Cao, J.; Tsujishima, H.; Cox, R. J. “Asymmetric, Stereocontrolled Total Synthesis of Paraherquamide A” J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 12172-12178.

4) Yang, D.; Gao, Q.; Zheng, B-F.; Zhu, N-Y. „Et₂AlCl-Promoted Asymmetric Phenylseleno Group Transfer Radical Cyclization Reactions of Unsaturated β-Hydroxy Esters” J. Org. Chem. 2004, 69, 8821-8828.

5) Wohlrab, A.; Lamer, R.; VanNieuwenhze, M. S. “Total Synthesis of Plusbacin A₃: A Depsipeptide Antibiotic Active Against Vancomycin-Resistent Bacteria” J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 4175-4177.

6) Ikunaka, M. “A Process in Need Is a Process Indeed: Scalable Enatioselctive Synthesis of CHiral Compounds for the Pharmaceutical Industry” Chem. Eur. J. 2003, 9, 379-388.

7) Sugai, T.; Ritzen, H.; Wong, C-H. “Towards the Chemoenzymatic Synthesis of Lipid A” Tetrahedron: Asymmetry 1993, 4, 1051-1058.

8) Fukase, K.; Liu, W-C.; Suda, Y.; Oikawa, M.; Wada, A.; Mori, S.; Ulmer, A.J.; Rietschel, E.Th.; Kusomoto, S. “Synthesisi of an Analog of Biosynthetic Precursor 1a of Lipid A by an Improved Method: A Novel Antagonist Containing Four (S)-3-Hydroxy Fatty Acids” Tetrahedron Letters 1995, 36, 7455-7458

9) Guaragna, A.; De Nisco, M.; Pedatella, S.; Palumbo, G. “Studies towards lipid A: a synthetic strategy for the enantioselective preparation of 3-hydroxy fatty acids” Tetrahed. Asymm. 2006, 17, 2839-2841

10) Clay, R. J.; Collom, T. A.; Karrick, G. L.; Wemple, J. “A Safe Economical Method for the Preparation of β-Oxo Esters” Synthesis 1992, 290-292.

11) Benetti, S.; Romagnoli, R.; De Risi, C.; Spalluto G.; Zanirato, V. “Mastering β-Keto Esters” Chem. Rev. 1995, 95, 1065-1114.

12) Magano, J.; Nanninga, T. N.; Winkle, D. D. “Expeditious, large scale preparation of ethyl (R)-5-methyl-3-oxo-octanoate via cross Claisen reaction between N-acyl oxazolidinone derivatives and the magnesium enolate of potassium ethyl malonate” Tetrahed. Lett. 2008, 49, 2956-2959.

13) Ruth, K.; Grubelnik, A.; Hartmann, R.; Egli, T.; Zinn, M.; Ren, Q. “Efficient Production of (R)-3-Hydroxycarboxylic Acids by Biotechnological Conversion of Polyhydroxyalkynoates and Their Purification” Biomacromolecules 2007, 8, 279-286.

13) Kramer, R.; Brückner,R. “Discrimination of β-Ketoesters by Ruthenium(II)-Binap-Catalysed Asymmetric Hydrogenation” Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 6537-6541.

14) Kramer, R.; Brückner, R. “Asymmetric Hydrogenations One by One: Differentiation of up to Three β-Ketocarboxylic Acid Derivatives Based on Ruthenium(II)-Binap Catalysis” Chem. Eur. J. 2007, 13, 9076-9086.

15) Servi, S. “Baker’s Yeast as a Reagent in Organic Synthesis” Synthesis 1990, 1-22.

16) Csuk, R.; Glänzer, B. “Baker’s Yeast Mediated Transformations in Organic Chemistry” Chem. Rev. 1991, 91, 49-97.

17) Seebach, D.; Sutter, M. A.; Weber, R. H.; Züger, M. F. “Yeast reduction of ethyl acetoacetate” Org. Synth. 1990, 7, 215-

18) Chin-Joe, I.; Nelisse, P. M.; Straathof, A. J. J.; Jongejan, J. A.; Pronk, J. T.; Heijnen, J. J. “Hydrolytic Activity in Baker’s Yeast Limits the Yield of Asymmetric 3-Oxo Ester Reduktion” Biotech Bioengin 2000, 69, 370-376

19) Chin-Joe, I.; Straathof, A. J. J.; Pronk, J. T.; Jongejan, J. A.; Heijnen, J. J “ Influence of the Ethanol and Glucose Supply on the Rate and Enantioselectivity of 3-Oxo Ester Reduction by Baker’s Yeast” Biotech Bioengin 2001, 75, 29 – 38

20) Rodriguez, S.; Kayser, M. M.; Stewart, J. D. „Highly Stereoselective Reagents for β-Keto Ester Reduction by Genetic Engineering of Baker’s Yeast” J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1547-1555.

21) Yang, Z-H.; Yao, S-J.; Lin, D-Q. “Improving the Stereoselectivity of Asymmetric Reduction of 3-Oxo Ester to 3-Hydroxy Ester with Pretreatement on Baker’s Yeast” Ind. Eng. Chem. Res. 2004, 43, 4871-4875 und zit. Lit.

22) Fow, K-L.; Poon, L. C. H.; Sim, S. T.; Chuah, G. K.; Jaenicke; S.; “Enhanced Asymmetric Reduction of Ethyl 3-Oxobutyrate by Baker’s Yeast via Substrate Feeding and Enzym Inhibition” Eng. Life Sci. 2008, 8, 372-380 und zit. Lit.

23) Yang, Z-H.; Yao, S-J.; Guan, Y-X. “A Complex Process of Asymmetric Synthesis of β- Hydroxy Esters by Baker’s Yeast Accompanied by Resin Adsorption” Ind. Eng. Chem. Res. 2005, 44, 5411-5416.

24) Hirama, M.; Shimizu, M.; Iwashita, M. “Enantiospecific Synthesis of Trifunctional (R)-3-Hydroxy Esters by Baker’s Yeast Reduction” J. Chem. Soc. Chem. Com. 1983, 599-600.

25) Utaka, M.; Higashi, H.; Takeda, A. “ Asymmetric Reduction of 3-Oxo-octadecanoic Acid with Fermenting Baker’s Yeast. An Easy Synthesis of Optically Pure (+)-(2R,3R)-Corynomycolic Acid” J. Chem. Soc. Chem. Com. 1987, 1368-1369.

26) Utaka, M.; Watabu, H.; Higashi, H.; Sakai, T.; Tsuboi, S.; Torii, S. “Asymmetic Reduction of Aliphatic Short- to Long- Chain β-Keto Acids by Use of Fermenting Baker’s Yeast” J. Org. Chem. 1990, 55, 3917-3921

27) Fischer, P.; Heitzer, W.; Thielacker R. Präparatives Praktikum für chemisch-technische Assistenten, Thieme, Stuttgart, p 80. 1988

28) Bornscheuer, U.; Herar, A.; Kreye, L.; Wendel, V.; Capewell, A.; Meyer, H.; Scheper, T.; Kolisis, F. “Factors affecting the lipase catalyzed transesterification reactions of 3-hydroxyesters in organic solvents” Tetrahed Asymm 1993, 4, 1007–1016.

29) Bornscheuer, U. T.; Kazlauskas, R. J. „Hydrolases in Organic Chemistry“, 2nd Ed. 2006, Wiley-VCH, Weinheim

30) Fishman, A.; Eroshov, M.; Sheffer Dee-Noor, S.; van Mil, J.; Cogan, U. Effenberger, R. “A Two-Step Enzymatic Resolution Process for Large-Scale Production of (S)- and (R)-Ethyl-3-Hydroxybutyrate” Biotech Bioengin 2001, 74, 257 – 263